小鼠小肠类器官作为一种体外模型，广泛应用于肠道疾病研究、药物筛选等领域。类器官构建细胞来源通常有原代细胞和干细胞两种，由于小鼠肠道原代细胞来源广泛、能够更好地模拟体内真实情况、培养相对简单，能够满足大多数研究和应用需求，因此，小鼠小肠类器官通常使用组织分离出的原代细胞构建。今天我们就来看看如何利用原代细胞构建小鼠小肠类器官。

材料准备

♦ 实验动物：根据实验要求选择合适的小鼠品系。

♦ 实验试剂：小鼠小肠类器官用培养基（可自行配制，也可直接购买），基质胶，DPBS，组织消化液等。

♦ 实验耗材：无菌操作所需的培养皿、离心管、移液枪头、24孔板等，以及用于细胞过滤的70μm细胞滤网。

实验步骤

♦ 小肠组织取材

1. 小鼠处死后，表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近胃端处3-15cm肠组织，用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含1%双抗的DPBS溶液中。

2. 使用注射器冲洗肠道2-3次，用手术剪将肠管小心剪开，肠腔面朝上，用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后（呈现透明），将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗2-3次。

♦ 隐窝分离

1. 将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽大小，转移至新的50ml离心管中，用DPBS小心清洗3-5次，除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。

2. 在清洗好的小肠碎片组织加入10-15ml含有3-5mM EDTA的预冷DPBS中消化，4℃孵育30min左右，其间每10min轻摇一次离心管。

3. 消化完成后，弃去EDTA消化液上清，用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2-3次以去除剩余EDTA。

4. 在小肠组织碎片中加入10-15ml预冷的含0.1%BSA的DPBS，反复吹打、重悬，使隐窝与基底层分离，然后取少许悬液镜检，当看有大量隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液使用70μm滤网过滤并收集穿过滤网的组织悬液。

5. 收集得到的组织悬液，1500rpm、4℃离心3min。

♦ 基质胶包埋与培养

1. 用基质胶重悬隐窝组织沉淀，使每10μL基质胶悬液包含200-600个隐窝，重悬后混合液置于冰上，尽快操作以避免基质胶凝固。

2.  将混合悬液种植于24孔板底部正中央，每孔30-50μL左右，不接触孔板侧壁。

3. 将种植后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30min左右待基质胶凝固。

4. 待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入小鼠肠类器官培养基，每孔800μL/孔。

5. 将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并监测类器官生长状态（一般小鼠小肠类器官在5-7天内形成）。

小鼠小肠类器官不同天数生长情况

注意事项

♦ 无菌操作：整个构建过程需严格遵守无菌操作原则，避免污染。

♦ 温度控制：基质胶操作需在冰上进行，避免其提前凝固；培养基在使用前需恢复至室温。

♦ 操作轻柔：在分离隐窝和处理基质胶时，动作要轻柔，避免产生气泡或破坏隐窝结构。

希望以上内容能够帮助你顺利构建小鼠小肠类器官，有问题欢迎大家留言讨论哦。

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